Die Galerie wurde Ende des 16. Jahrhunderts von den Medici begründet und stellt heute die angesehenste Pinakothek Italiens dar.

Sie beherbergt zahlreiche berühmte Werke der bekanntesten italienischen Meister, z. B. Primavera (Der Frühling) und Geburt der Venus von Botticelli, l'Adorazione dei Magi (die heiligen drei Könige) und L'Annunciazione (die Verkündigung) von Leonardo da Vinci, Il Tondo Doni von Michelangelo, La Madonna del Cardellino von Raffaello sowie weitere Meisterwerke von Cimabue, Giotto, Simone Martini, Masaccio, Paolo Uccello, Piero della Francesca, Filippo Lippi.

Einige Säle der Galerie sind den Manieristen und den flämischen Meistern, andere den spanischen Künstlern, den grossen venezianischen Malern bis zu Tiepolo, der französischen und der deutschen Schule gewidmet. Entlang des Bogengangs sind wichtige Skulpturen der Klassik und der Renaissance zu bewundern.

Auf keinen Fall entgehen lassen sollte man sich den charakteristisschen Corridoio Vasariano, der den Palazzo Vecchio mit dem Palazzo Pitti verbindet und dabei unter der Ponte Vecchio verläuft. Des weiteren beherbergen die Uffizien die Sammlung Contini-Bonacossi.