Il primo nucleo fu acquistato nel 1550 da Eleonora di Toledo, moglie di Cosimo I de' Medici, dalla famiglia Pitti. Il progetto di sistemazione del giardino fu intrapreso da Niccolò Pericoli, detto il Tribolo; dopo la sua morte nel 1555, la direzione dei lavori fu assunta da Davide Fortini e successivamente, fra il 1554 e il 1561, da Giorgio Vasari.

Dopo il 1574 Francesco I fece subentrare come architetto Bernardo Buontalenti, che realizzò la Grotta Grande. La Grotta Grande, o del Buontalenti, è uno degli elementi più pregevoli del parco. Iniziata dal Vasari, che creò la parte inferiore della facciata, la sua costruzione si deve soprattutto a Bernardo Buontalenti, che la creò tra il 1583 e il 1593, come sacrario dedicato all'amore cortese.

La grotta artificiale è un capolavoro dell'architettura e della cultura manierista e rappresenta una singolarissima commistione tra architettura, pittura e scultura. Non a caso vi erano collocati fino al 1924 i quattro Prigioni incompiuti di Michelangelo, oggi conservati alla Galleria dell'Accademia e sostituiti da copie, dove queste statue incomplete, create originariamente per la tomba di papa Giulio II, ben si adattavano all'ambiente della prima stanza.

Con la restaurazione lorenese si riportò Boboli all'aspetto formale che aveva avuto sin dalle sue origini. Nel 1834, sotto Leopoldo II, il giardino subì la distruzione dei labirinti per l'apertura di un grande viale carrozzabile, su progetto di Pasquale Poccianti. Durante questo secolo il giardino è stato lo scenario di celebri spettacoli all'aperto.